Mit 20 bis 28 Millimeter Körperlänge zählen die Tiere zu den größten Vertretern der Bienen in Mitteleuropa. Ihr Körper ist tiefschwarz und hat eine hummelähnliche Erscheinung, der ansonsten blauschwarze Thorax ist am Rücken grau gefärbt. Auch die Flügel sind sehr dunkel und weisen einen auffälligen blauen Schiller auf. Am Kopf befinden sich neben den großen schwarzen Facettenaugen auch drei kleinere Punktaugen auf der Stirn. Diese Neben-Augen sind bei der Wahrnehmung der Lichtintensität hilfreich, aber vor allem
beim Fliegen. Die Holzbiene hat also insgesamt fünf Augen, wie viele andere Insekten auch. Der Körper ist relativ kurz behaart. Die Weibchen können in Mitteleuropa im Feld nicht von der Xylocopa valga unterschieden werden. Die ähnlichen Männchen weisen einen braunroten Ring vor der etwas abgeknickten Fühlerspitze auf und können damit gut bestimmt werden. In Südeuropa kann die Art mit mehreren ähnlichen Arten der Gattung verwechselt werden. Die Weibchen besitzen, wie viele andere Bienenarten auch, einen Giftstachel,
den sie zur Verteidigung einsetzen.

