Die Weibchen graben eine Röhre in den Boden, die bis zu einem Meter lang sein kann. Diese endet in fünf bis sieben Kammern, in die im Normalfall drei bis vier, aber auch teilweise bis zu sechs gelähmte Honigbienen gebracht werden. Diese dienen zur Ernährung des Nachwuchses, wobei künftige Weibchen eine Biene mehr benötigen als die Männchen.
Lange Zeit wurde angenommen, dass die betäubten Bienen durch das Gift, welches nur eine lähmende Wirkung hat, haltbar gemacht werden
und so nicht verderben. Nach Erkenntnissen der Forschergruppe um Erhard Strohm vom Biozentrum der Universität Würzburg konnte anhand einer Versuchsreihe nachgewiesen werden, dass die Haltbarmachung durch eine spezielle Behandlung der Biene durch den Bienenwolf erfolgt. Dabei leckte der Bienenwolf die Biene mit seinen Mundwerkzeugen intensiv ab. Durch diese spezielle Behandlung bleiben die Bienen mehrere Tage unverdorben. Unbehandelte, aber durch das Gift des Bienenwolfes betäubte Tiere verdarben schon nach wenigen Stunden (Schimmelbefall).
In leicht geneigtem oder
horizontalem Gelände wird nach jedem Besuch des Nestes dieses zum Schutz vor Nesträubern, wie etwa diversen Käfern oder Schlupfwespen, verschlossen. Im senkrechten Gelände wird der Eingang ständig offen gehalten.
Aus den anschließend gelegten Eiern schlüpfen weiße, madenförmige Larven. Nach dem Verspeisen der erbeuteten Bienen verpuppen sich die Larven so geschickt auf einem Seidenstiel, dass sie weder Boden noch Wände berühren; dadurch wird zusätzlich verhindert, dass die Puppe (Kokon), begünstigt durch die Feuchtigkeit, womöglich von Pilzen befallen
wird. Ungefähr Mitte Juni eines Jahres gräbt sich dann die neue Generation Bienenwölfe aus ihrer Höhle im Erdreich.